ELISA操作有何難?

    ELISA具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體的測(cè)定，為輔助臨床診斷與生物科研起到了積極的推動(dòng)作用。但ELISA測(cè)定中影響因素較多，操作過(guò)程中每個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。



    試劑的因素

    試劑的選擇：試劑的選擇是保證血液檢測(cè)質(zhì)量的關(guān)鍵要素。雖然國(guó)家采用批批檢定的形式對(duì)ELISA試劑嚴(yán)格把關(guān)，但不同廠家的試劑在使用效果上仍存在在差異。要選購(gòu)度相對(duì)高、具有“三證”的試劑，不要用無(wú)批號(hào)的試劑，選用與儀器配套的試劑。更不要使用過(guò)期的試劑和混用不同批號(hào)的試劑。

    操作中的因素

    加樣：孵育前加樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶試劑加出孔外，使用滴瓶滴加試劑時(shí)，滴加的角度不同和擠壓的力度不同，致使滴加的試劑量不準(zhǔn)，都可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。
    控制方法：
    ①實(shí)驗(yàn)樣本過(guò)多時(shí)，可分批次操作，以減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)造成的誤差；
    ②加酶試劑后，用吸水紙吸干孔外試劑；
    ③作定量試驗(yàn)時(shí)，使用加樣器加注試劑，并經(jīng)常校正其準(zhǔn)確性，此外，要做到一份樣本一個(gè)移液頭，防止交叉污染。

    溫育：溫育是ELISA測(cè)定為關(guān)鍵、容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟。為常見(jiàn)的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2-8℃。目前國(guó)內(nèi)售ELISA試劑盒溫育時(shí)間為37℃，30 min-1 h，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃，1-2 h能有較*的結(jié)合。

    溫育時(shí)間、溫度的選擇一般根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū)選擇溫育的時(shí)間、溫度。加完樣本和（或）試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時(shí)，孔內(nèi)溫度從室溫升至37℃需要一定時(shí)間，如果是將微孔板一放入溫箱即開(kāi)始計(jì)時(shí)，這樣就容易造成實(shí)際測(cè)定中溫育時(shí)間不夠，易致弱陽(yáng)性標(biāo)本測(cè)不出來(lái)。
    控制方法：
    ①如有兩種溫度，盡量使用較低的溫育溫度、較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間的條件；
    ②用1個(gè)小溫度計(jì)放置在板孔反應(yīng)液中測(cè)量觀察。

    “邊緣效應(yīng)”的排除“邊緣效應(yīng)”是在使用96孔板的ELISA測(cè)定中，外周孔顯色較中心孔深的現(xiàn)象。產(chǎn)生的原因可能是為96孔板周?chē)着c中心孔在溫育中的熱力學(xué)梯度造成的，因此在溫育時(shí)盡量采用水浴。
洗板：ELISA測(cè)定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機(jī)洗板。采用手工洗板，孔與孔之間液體易交叉，采用半自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，洗液量不足導(dǎo)致洗板不*，洗板針堵塞導(dǎo)致抽吸不*，洗板不暢導(dǎo)致清洗效果差。
    控制方法：
    ①手工洗板時(shí)，拍板時(shí)要垂直，避免交叉污染，用力不能過(guò)猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離；
    ②洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時(shí)可用注射器針頭挑出；
    ③為了洗滌效果好，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法，在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1-2次，或適當(dāng)增加洗板的次數(shù)，有資料報(bào)道洗板7次能達(dá)到理想的洗滌效果。

    顯色：市售ELISA試劑盒中，如以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應(yīng)用液；如以鄰苯二胺(OPD)為底物，則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑。顯色反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15-30 min。以鄰苯二胺(OPD)為底物的試劑，要臨用前30 min配制且必須避光。以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物的試劑則不需避光，但A、B液應(yīng)盡量避免接觸金屬器械。

    結(jié)果判定：讀取結(jié)果要在15-30 min內(nèi)完成，定性測(cè)定用肉眼判讀試驗(yàn)結(jié)果時(shí)，反應(yīng)板應(yīng)水平距離白色背景10-15 cm；定量測(cè)定時(shí)用酶標(biāo)儀讀取結(jié)果，酶標(biāo)儀不應(yīng)置于陽(yáng)光或強(qiáng)光照射下，需先預(yù)熱15-30 min再進(jìn)行測(cè)試。

    綜上所述，盡管ELISA法操作簡(jiǎn)單，但可能影響測(cè)定結(jié)果的因素也較多。故在實(shí)際操作的過(guò)程中，要加強(qiáng)質(zhì)量管理，認(rèn)真避免或減少影響因素，力求結(jié)果準(zhǔn)確，為疾病的診斷和科研提供可靠的依據(jù)。