您的免疫組化實驗遇到瓶頸了嗎?

   關注上海恒遠生物，掌握科研資訊及科研實驗中的那些事兒。不知您的免疫組化實驗遇到瓶頸了嗎?今天小編給大家帶來的是免疫組化的實驗步驟剖析，希望您會喜歡！


1.標本固定：固定的目的是①防止標本從玻片上脫落；②除去防礙抗原-抗體結合的類脂，使抗原抗體結合物易于獲得良好的染色結果；③固定的標本易于保存。固定劑的選擇一般用 4%多聚甲醛。
2.脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對組織要*浸蠟、切片時刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。
3.脫蠟和水化：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結合反應。脫蠟可以先 60 度 20min，但當天制好的切片一般先 60 度 3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全易產生非特異性背景著色。
4.抗原修復：由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復方法從強到弱一般分為三種，高壓修復、微波修復、胰酶修復。修復液也分為若干種（具體的可以查閱相關資料，大量的：中性的、高pH 的等）。
5.細胞通透：目的是使抗體能夠充分地進入胞內進行結合反應。一般用 Triton X-100、蛋白酶 k 等通透液。如 Triton X-100 可以溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質而使抗體及大分子結構的物質進入胞漿和胞核內，故在細胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進入胞內與相應抗原結合。
6.滅活內源性過氧化物酶和生物素：在傳統的 ABC 法和 SP 法中，免疫組化反應結果容易受到內源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進行滅活
7.血清封閉：組織切片上有剩余的位點可以與一抗非特異性結合，造成后續結果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預先能和組織中有交叉反應的位點發生結合；一般室溫 10- 30min。但也要防止封閉過度
8.一抗和二抗濃度和孵育時間：一抗孵育條件在免疫組化反應中zui重要，包括孵育時間、溫度和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種： 4 度、室溫、37 度，其中 4 度效果*；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關，一般 37 度 1-2h，4 度過夜（從冰箱拿出后 37 度復溫 45min） 。具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或 37 度 30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。
9.抗體稀釋液：其實許多實驗室抗體稀釋液就用一般 PBS 即可，但的抗體稀釋液中除 PBS 成份外，還加了*防腐劑、BSA 穩定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好
10.切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，注意：①單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。②溫柔沖洗，防止切片的脫落，一般用浸洗方式；③沖洗的時間要足夠，才能*洗去結合的物質。④PBS 的 PH 和離子強度的使用和要求（建議 PH 7.4- 7.6，濃度是 0.01M；  中性及弱堿性條件有利于免疫復合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強度有利于免疫復合物的形成，而高離子強度則有利于分解）
11.DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由 DAB 孵育條件決定。 DAB 顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現特異性染色較強而本底著色較淺時即可沖洗
12.復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位，經常用蘇木素復染（胞核染料）
13.封片： 為了長期保存，我們一般用中性樹膠等封片，避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。